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    技术支持

    致力于引进国外先进技术,为广大科研工作者和医疗机构提供高质量 的科研技术支持 。

    常见问题解答

    常见问题解答

    Q:

    PCR产物经克隆后测序发现,引物处的碱基有错误,怎么办?

    A:

    A15:因为引物纯度不可能是100%,因此,挑选克隆时,有可能挑选了杂质引物扩增出的PCR产物的克隆。此时,请重新挑选一个克隆测序,会得到正确的结果。如果挑选2 ~ 3个克隆测序情况还没改观,我们会免费重新合成引物并以最快的速度送到您的手里。如进行索赔时,按国际行业惯例,索赔范围限于制品价格范围之内。

    Q:

    能否根据引物电泳后EB染色后条带的亮度对合成的引物进行定量?

    A:

    A14:不能。因为EB是通过嵌入到核酸的双螺旋间而使其着色的。合成的DNA分子为单链,只有通过自身回折形成局部发夹环结构或链间形成部分双螺旋结构,才能被EB染色。由于不同引物的序列不同,形成双螺旋的能力不同,因此染色能力不尽相同,也就不能根据EB染色带的亮度来对合成的DNA进行定量。

    Q:

    合成的引物进行PCR反应时无目的条带,如何解释?

    A:

    PCR反应失败的原因很多,可以从以下几个方面考虑:引物和模板是否配对,同源性有多大;引物本身是否有立体结构;PCR反应用试剂是否能正常工作;PCR仪是否工作正常;PCR反应条件是否合适;如果一切正常,还无法解决问题时,我们可以免费重新合成引物。

    Q:

    使用3%Agarose凝胶电泳分析合成的引物,发现有很多条泳带?

    A:

    对引物进行电泳一定要使用变性PAGE电泳。由于引物是单链DNA,容易形成复杂的立体结构,因此进行Agarose电泳时,容易出现多条泳带,更无法用Agarose电泳进行定量了。

    Q:

    测定了引物的OD值后发现A260/A280<1.8,引物纯度合格吗?

    A:

    由于核酸在260nm附近有强吸收,而蛋白质在280nm附近有强吸收,从生物体内提取核酸时,常用A260/A280比值来评价核酸纯度(比值在1.8~2.0之间),这一判断是基于序列中A、G、C、T所占比例大致相同时的结果。而合成的DNA/RNA则不同,序列很短 (通常在20~30个碱基之间),其中A、G、C、T各种碱基所占比例很不相同,由于各种碱基的摩尔消光系数不同,因此不同碱基构成的引物的A260/A280比值也不同,例如当序列中C、T碱基的含量高时,该比值会大大低于1.8。所以不能用A260/A280的比值来判断引物的纯度。

    Q:

    一般合成的引物末端有磷酸基团吗?

    A:

    没有,5和3末端均为-OH基。如需要加磷酸基团,则需要使用修饰合成增加磷酸化。

    Q:

    如何检测引物的纯度?

    A:

    实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的一定浓度的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,<12个碱基的引物用20%的胶,12-60个碱基的引物用16%的胶,>60个碱基的引物用12%的胶,取0.2OD左右的引物,用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和,上样前加热变性(95oC,2mins)。加入尿素的目的一是变性,二是增加样品比重,容易加样。600V电压进行电泳,一定时间后(约2-3小时),剥胶,用荧光TLC板在紫外灯下检测带型,在主带之下没有杂带,说明纯度是好的(有时由于变性不充分,主带之上可能会有条带,乃是引物二级结构条带)。

    Q:

    为何长链引物的合成费用比短链引物的要高?

    A:

    通常在合成长链引物时,试剂的加入量要比短链引物多很多,尤其是大于90bp以上的引物,由于成本的增加,从而导致价格也要增加。

    Q:

    艾基生物可以为您合成多长的序列?

    A:

    150碱基以下。

    Q:

    如何计算oligo的摩尔数?

    A:

    1个OD值的Oligo的重量约为33 μg,而每个碱基的平均分子量一般按330道尔顿进行计算。因此, 合成oligo的nmol数一般按以下公式粗略地计算: nmole数=(OD值x33μg)/(碱基数x330)x1000=OD值/碱基数x100如果需要计算合成DNA的精确浓度,请按以下公式进行计算: nmole数=(OD值x1000)/[ (15.3xA#)+(7.4xC#)+(11.8xG#)+(9.3xT#) ]

    Q:

    oligo如何定量?

    A:

    用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的吸光度来定量,测定时溶液的吸光度最好稀释到0.2-0.8之间(吸光度太高或太低会有较大的误差)。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后,取部分溶液稀释到1ml并在1ml标准比色皿中测定其吸光度,即为所测体积的OD值,进而可以计算出母液的OD值。

    Q:

    oligo如何保存?

    A:

    没有溶解的引物非常稳定,可以在-20℃下保存至少1年,溶解好的引物可以事先稀释为100μmoL/L的储存液,分装数管保存于-20℃冰箱,可以保存至少半年以上(反复多次冻融会降低使用寿命)。使用前,将浓溶液稀释成工作液后进行实验。

    Q:

    oligo如何溶解?

    A:

    我们的合成报告单给出了每OD引物稀释为100μmoL/L(即100pmol/ul)浓度的加水量,您可以根椐您的实验需要加入适量的无核酸酶的双蒸水(PH>6.0)或TE缓冲液(PH 7.5-8.0),开启瓶盖溶解之前最好在3000-4000转/分钟的转速下离心1分钟,防止开盖时引物散失。

    Q:

    艾基引物纯化方式?

    A:

    纯化方式 详细说明 C18 柱脱盐 又称为简易反相柱,对DNA 有特异性吸附,可被有机溶液洗脱,但不会被水洗脱,因此能有效地去除盐分。 R-PAGE 基于特异或反向层析法, 从合成好的产物中去除失败序列,适于35 个碱基以下的引物。 PAGE 纯化 PAGE 纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,对引物DNA 进行分离,然后从凝胶中回收目的DNA。 HPLC 纯化 HPLC 纯化是使用高效液相色谱的原理,对引物DNA 进行纯化。该方法用于分离纯化或分析时能达到很高的纯度和灵敏度。常用的有离子交换HPLC 和反相HPLC。

    Q:

    引物是如何合成的?

    A:

    目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种,无论采用什么机器合成,合成的原理都相同,主要差别在于合成产率的高低,试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。(1) 去保护:加入Deblocking脱去碱基上5'- OH的保护基团 DMT ,获得游离的 5'- OH;(2) 耦合:同时加入活化剂和新的碱基,新的碱基 5'- OH仍然被 DMT 保护,3' 端被活化与溶液中游离的 5'- OH发生耦合反应;(3) 封闭:耦合反应中极少数 5'- OH没有参加反应 ,用封闭试剂终止其后继续发生反应;(4) 氧化:加入氧化剂使其由核苷亚磷酸酯形成更稳定的核苷磷酸酯。合成后处理:切割与脱保护基:将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来…

    Q:

    怎样处理特殊大小的细胞?

    A:

    有的细胞特别大或特别小,特别是一些原代细胞,还有的细胞成团无法计数。对于这种细胞,从预实验开始就会有所不同。预实验时,保持感染时细胞的汇合率达到30~40%,即使细胞没有预定的10000 个/孔的数目,正式实验的细胞汇合率应尽量控制在这个数量。对于成团的细胞,如胰岛细胞,胚胎干细胞等,应注意细胞团的数目和大小,以便以后的实验按比例放大。

    Q:

    加入病毒后,目的细胞死亡很多,为什么?

    A:

    Lentivirus可能对您的目的细胞有一定的毒性,请调整并降低感染的MOI值,并且在感染4 h、8 h、12 h后对细胞进行换液,用新鲜的完全培养液继续培养观察。

    Q:

    目的细胞可以被Lentivirus感染,但是GFP荧光强度很低,为什么?

    A:

    目的细胞中GFP荧光强度取决于病毒感染细胞的颗粒数、细胞本身的增殖状态、细胞类型以及观察时间等。一般来讲,目的细胞感染病毒颗粒数越多,细胞本身增殖越快,GFP荧光会较强。Lentivirus属于慢病毒,一般在增殖较快的细胞中病毒感染48~72h后,GFP基因表达才达到高峰。对于增殖较慢的细胞,GFP基因表达时间还会延长。

    Q:

    Lentivirus对目的细胞的感染效率很低,如何提高病毒的感染效率?

    A:

    一般我们通过提高MOI值来提高病毒的转染效率,必要时可在培养液中加入Polybrene (4~10 μg/mL)来提高病毒的感染率。同时,目的细胞良好的生长状态是获得正常感染效率的保证。

    Q:

    常见细胞推荐的MOI

    A:

    常见细胞推荐的MOI

    Q:

    Lentivirus在细胞水平的使用

    A:

    艾基提供的Lentiviral Vector Particle为VSVG膜蛋白包裹的,虽然与其他的膜蛋白相比,它能够感染的细胞种类大大增加,但是对不同的细胞和组织的感染性仍有差别。在使用Lentivirus之前请查阅相关文献,了解这种Lentivirus对目的细胞的亲嗜性,复感染指数(MOI值)以及在体内(in vivo)注射所需要的病毒量。如果没有相关文献支持,则需要检测病毒对目的细胞的亲嗜性。实际上即使有文献支持,但因为不同实验的细胞代数,个体差异,细胞状态的关系,细胞实际的MOI和文献报道的往往会有差异。因此,正式实验前一般会安排预实验,以了解细胞所需MOI以及病毒对细胞状态和传代的影响。1. 目的细胞感染预实验 说明:MOI值:感染复数或复感染指数,是“mui…

    Q:

    Lentivirus使用安全注意事项

    A:

    艾基提供的慢病毒载体属于“第二代”慢病毒载体,其基因组的3’ LTR的增强子功能发生了缺失,从而形成了所谓的“自灭活”(Self-inactivation,SIN),即该病毒基因组整合到细胞基因组后,不会产生新的子代病毒,也降低了对周围基因的意外激活,因此具有较好的安全性。但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险,所以建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒。除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性,否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验,如有疑问,请与我们联系。使用时请参照如下所示进行实验:1. 病毒操作时请使用生物安全柜(BSL-2)。2. 病毒操作时请穿实验服,戴口罩和手套。3. 操作病毒时应小心,避免产生气溶胶,如果操作…

    Q:

    Lentivirus的储存与稀释

    A:

    1. 收到病毒液后4℃保存(请于一周内用完),如需长期保存则存放于-80℃。避免反复冻融,否则会降低病毒滴度,一般病毒可以存放于-80℃约6个月。6个月后使用,请重新检测病毒滴度。2. 艾基提供的Lentivirus溶于HBSS中 (pH7.4) 。病毒使用时,请将病毒从-80℃冰箱取出,冰浴融化,4℃存放。如有需要稀释病毒,则可加入适量的HBSS混匀使用,也可以用培养液进行稀释。3. “TU/mL”:Transducing Units,转导单位,表示可以感染并进入到目标细胞群中的病毒基因组数。艾基提供的慢病毒单位标识为TU/mL时,即每毫升慢病毒溶液中含有具有生物活性的慢病毒颗粒数。如:病毒滴度>1×10∧8 TU/mL,即每毫升病毒液中至少含有1×10∧8个具有生物活性的病毒颗…

    Q:

    全基因组de novo测序常见问题

    A:

    如何保证组装结果的可靠性?对于组装的结果,除了保证Contig N50和Scaffold N50两项指标外,还需要对组装质量进行评估。如利用EST数据和RNA数据进行完整性评估,即评估组装出来的基因的完整性;利用BAC数据检验是否有装断或装错的情况,以及利用保守基因评估(CEGAM评估/BUSCO评估)基因组组装的完整性。 小片段和大片段的DNA样品是否需要是一样的?(Survey和基因组 de novo 所用DNA是否需要一样的?)原则上进行 Survey 和 de novo 使用的 DNA 是来自一个个体的。如果DNA量不足以满足整个de novo项目,则建议小片段文库的DNA必须来自同一个体,大片段文库使用同一群体的另一个个体。 若样品提取困难,样品量不足,有什么办法可以解决?若老师那…

    Q:

    全基因组甲基化测序常见问题

    A:

    哪些物种可以研究WGBS?要做全基因组甲基化分析,对物种有以下要求:a. 物种为真核生物;b. 物种具有参考基因组,至少拼接到scaffold水平;c. 具有较为完整的注释。 全基因组甲基化测序有哪些优势?在全基因组水平,单碱基分辨率检出甲基化位点,不仅能够高精度发现CpG岛等常见区域的甲基化水平的变化,还能够分析gene body区,基因间区等区域的甲基化水平的差异,分析甲基化对染色体的状态以及基因结构变化的影响,从多维度分析解决生物学问题。

    Q:

    small RNA测序常见问题

    A:

    没有参考基因组的物种,可以做small RNA测序吗?无参考基因组的物种可以开展small RNA测序研究,但是需要先做无参转录组拼接转录本,以转录本作为参考序列用于small RNA测序分析。 已知miRNA分析中,样品的首位及各位碱基的偏好性统计图可以说明什么?miRNA前体发育为成熟体的过程是由Dicer酶酶切完成,酶切位点的特异性使得miRNA成熟体序列首位碱基对U具有很强的偏向性,而对G却排斥,但第二到四位缺乏U,一般来讲,除第四个碱基外,其他位置通常都缺乏C。 sRNA测序完成后如何进行实验验证?sRNA后续实验验证的方法有很多:1. qPCR,验证microRNA的表达;2. RIP-seq,通过RIP技术富集得到具有甲基化修饰的RNA或与目的蛋白特异结合的RNA, 对富集得…

    Q:

    circRNA测序常见问题

    A:

    用芯片技术和用二代测序技术分析circRNA有什么区别?芯片技术只能检测已知的circRNA,而且噪音信号比较大,现在对circRNA的研究相对较少,对circRNA的注释不全面;另外,circRNA的表达具有很强的时空特异性,我们又难以保证实验处理条件下获得的数据和数据库中收录的数据吻合,因此可能丢失大量特异表达的circRNA;二代测序技术使用先进软件对样本中circRNA进行筛选,不仅能分析已知的circRNA,更能获得新的circRNA,进一步丰富对circRNA的研究。 circRNA与lncRNA的差别是什么?结构上:circRNA没有自由的5’端和3’端功能上: circRNA功能研究比较单一,现在对于其是否能够像lncRNA一样在染色体水平、蛋白 质水平上具有调控作用,尚未可知,这些…

    Q:

    lncRNA测序常见问题

    A:

    哪些物种可以研究lncRNA?要做lncRNA分析,对物种有以下要求:a. 物种为真核生物;b. 物种具有参考基因组,至少拼接到scaffold水平;c. 具有较为完整的注释。 lncRNA测序,构建文库时为什么要去除rRNA?lncRNA中只有lincRNA的3’端带有polyA结构,其他lncRNA没有polyA结构,因此,为了获得更全的lncRNA信息,不建议采用oligo(dT)磁珠富集的方式。 lncRNA靶基因预测是怎么实现的?lncRNA作为调控性RNA,调控靶基因的方式主要有co-location与co-expression。co-location靶基因预测基本原理认为lncRNA的功能与其坐标临近的蛋白编码基因相关,于是将lncRNA临近位置的(上下游100K)蛋白编码基因筛出来作为其靶基因。co-expression靶基因预测基本原理认…

    Q:

    16S、18S、ITS等扩增子测序常见问题

    A:

    扩增子测序诺禾用Ion S5 XL平台,该平台有什么优势?Ion S5 XL所采用的技术为半导体测序,通过半导体芯片直接将化学信号转换为数字信号。该系统无激光光源,无光学系统,无照相系统;使用无标记的核苷酸及酶进行测序通过对H+ 的检测,明显改善碱基判读准确性。相比Illumina HiSeq PE250,该平台读长更长,无需拼接,周期更短。 16S测序哪个区域比较合适?艾基生物提供的几个测序区域来自文献调研,但是目前并没有研究表明哪个测序区域更好。有文章研究表明土壤样本,16S V4区(515F-806R)比较适合做扩增子研究,可检测的物种多样性更丰富,并且可重复性强(PNAS. 2013. 110(16): 6548-6553.)。 若关注环境中的真核微生物多样性,ITS测序和18S测…

    Q:

    微生物重测序常见问题

    A:

    重测序与基于基因组的变异检测有何差异?基于基因组的研究,可以比重测序获得更多变异信息,特别是基因组中高变异的区域,以及部分新基因信息。此外,对于亲缘关系较远的菌株,由于高变区域较多,借助基因组手段效果会更理想。而重测序的优势主要在于成本方面。对于大量近缘菌株间的进化研究,用重测序结果作为研究基础是足够的,可以用同样的费用获得更多材料的变异信息。 基于重测序和基于单拷贝基因的进化分析有何差异?进化分析的基本要求,是找到不同基因组之间共有的保守序列,并通过序列间的差异,使用合适的数学模型构建菌株间的进化关系,通过重测序和单拷贝基因都能达到这样的目的。由于采用的数据集合有所差异,因此个别近缘物种的进化…

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